Robuste und spezifische Genregulation tool entwickelt für den primären Nervenzellen im Gehirn
Ein leistungsfähiges neues Werkzeug für die neurowissenschaftliche Untersuchung der Entwicklung des Gehirns, die Mechanismen von Gedächtnis und lernen, und die Rolle des Gehirns Störungen bei neuropsychiatrischen Erkrankungen wie sucht, depression, Schizophrenie und Alzheimer-Krankheit.
Diese molekulare Biologie-tool—entwickelt und validiert durch die Universität von Alabama an Birmingham-Forscher—ist in der Lage, selektiv und robust schalten Gene in Neuronen. Es wurde geliefert, um Neuronen wachsen in eine Schüssel, und noch wichtiger, es wurde auch geliefert Gehirn Neuronen in lebenden Erwachsenen Ratten. Das tool kann zur Erhöhung der expression eines einzelnen Gens oder die expression mehrerer Gene gleichzeitig, und der Betrag der erhöhten expression der gene gesteuert werden kann.
Diese selektive Fähigkeit zur Steigerung der Genexpression, was bedeutet, das gen macht mehr mRNA-codes für mehr protein—Forscher ermöglicht die Abfrage der Rolle einzelner Gene oder Gruppen von Genen.
Solche Abfragen sind Bausteine, um zu lernen, wie die expression verschiedener gene Programme während der Entwicklung steuert Gehirn Wachstum, die Verkabelung und die Typen von Neuronen erstellt. Für das Erwachsene Gehirn, das tool kann helfen, zu erklären, wie gene und Programme verändert, indem Sie die neuronale Aktivität und Verhaltenstherapie Erfahrung führen zu adaptiven Verhalten. Das tool kann auch helfen, untersuchen dysregulation des gen-Programme—von denen viele eine Rolle bei neuropsychiatrischen Erkrankungen, die auftreten, während der Entwicklung des Gehirns oder in den voll entwickelten adulten Gehirn.
Das tool nutzt bekannte CRISPR-basierte Technologie, die verpackt wurde in lentivirale Vektoren für die stabile Einführung in die Neuronen.
„CRISPR-basierte Technologie hat neue Wege zu befragen gene Funktion, aber Schwierigkeiten bei der transgen-expression in post-mitotischen Neuronen verzögert Einbindung dieser tools in das zentrale Nervensystem“, sagte Jeremy Day, Ph. D., Leiter des UAB research-team. „Hier zeigen wir, dass wir eine hoch effiziente, neuron-optimierte dual lentiviralen CRISPR-basierte Transkriptions-Aktivierungs-system kann der robuste, modulare und flexible gen-Induktion und Multiplex-Genregulation über mehrere primär-Nager-Neuronen-Kultur-Systeme.“
Tag ist ein assistant professor in der Abteilung von Neurobiologie an der UAB School of Medicine und wissenschaftlicher Mitarbeiter der UAB Civitan International Research Center. Die Studie ist veröffentlicht in der Zeitschrift eNeuro, mit Katherine E. Savell und svetlana V. Bach, Ph. D., UAB-Abteilung von Neurobiologie, als Erster co-Autoren.
„Mit der Entwicklung des CRISPR-Technologie, wurden wir in der Lage, selektiv Bearbeiten, Gene und gen-expression auf Nachfrage,“ sagte Erin Calipari, Ph. D., assistant professor an der Vanderbilt Brain Institute an der Vanderbilt University, die wurde in der Studie nicht beteiligt. „Damit wurde ein leistungsfähiges neues Werkzeug für die Verknüpfung der Effekte der Genexpression und-regulation, um die zelluläre Funktion und Verhalten; aber bis jetzt waren diese Systeme vor allem optimiert für die Verwendung in der Zellkultur.“
„Während es klingt trivial,“ Calipari sagte: „eine genetische Werkzeug von Kultur in-vivo-Verwendung ist unglaublich schwierig. Diese Technologie wird revolutionieren die Nutzung dieser Systeme in vivo zur Verknüpfung der Veränderungen in der transkriptionellen Regulatoren an bestimmten Genen, die in definierten Regionen des Gehirns, um neuronale Aktivität und Verhalten. Außerdem sind diese tools zu, dass für die region-gezielte manipulation einzelner Gene oder Gruppen von Genen, die in wach-und Verhaltensweisen der Tiere, die gehen, um uns eine beispiellose Sicht auf die Rolle der gen-expression im Verhalten.“
„Das Verständnis der grundlegenden Mechanismen für diesen Prozess“, sagte Sie, „ist der erste Schritt zur Entwicklung selektiver Therapien für psychiatrische Erkrankungen.“
Einzelheiten der Studie
Das CRISPR/Cas9-system ist weithin bekannt als molekulare Schere, die geschnitten werden kann, zu einem bestimmten Ort im Genom zu entfernen, ein gen oder fügen Sie ein gen. Eine inaktive form CRISPR/Cas9, die nicht in der Lage ist zu schneiden DNA kann verbunden werden mit putativer Effektoren zu aktivieren, die expression eines Gens an einer präzisen Stelle. Tag und Kollegen nutzten dieses system, genannt CRISPRa. Sie verpackte Sie in lentivirale Vektoren ermöglichen die stabile expression von CRISPR Maschinen, so dass die Forscher zu testen, Ihre Fähigkeit zu regulieren Gene, die in Neuronen. Das system umfasst ein CRISPR-defekt-Cas9, mit Aktivatoren und einem einzigen guide-RNA, die Führer der CRISPR-dCas9 zu einem präzisen Punkt auf dem Genom.
Eine Einschränkung der Verwendung von CRISPRa in Neuronen ist, dass die Promotoren, die Häufig verwendet werden, um Laufwerk molekulare Maschinen, die in anderen Arten von Zellen, die unwirksam waren bei der Fahrt CRISPR-expression in Neuronen. Um diese zu umgehen, die UAB-Forscher ausgewählt, eine neuron-spezifische Promotor, basierend auf die Promotor-Sequenz für den menschlichen Synapsin, oder SYN, gen, zu äußern, CRISPRa tool in Neuronen. Die UAB-Forscher entwickelten dann CRISPR single guide RNAs Ziel dieses Systems für eine Reihe von verschiedenen Genen, von kleinen Transkriptionsfaktoren an die große extrazelluläre Proteine. Sie zeigten, dass dieses system deutlich induzierte expression für jedes dieser gen-targets in primären Ratten-Neuronen aus dem Kortex, Hippokampus und striatum des Gehirns.
Verwendung von mehreren einzelnen guide-RNAs, die sogenannten multiplexing erlaubt tunable hochregulation von einzelnen Genen oder koordinierte hochregulation von mehreren Genen.
Die UAB-teams auch getestet, das system auf ein sehr Komplexes Gehirn gene, der brain-derived neurotrophic factor oder Bdnf. Bdnf ist extrem schwierig zu studieren, aufgrund seiner komplexen transkriptionellen Regulierung, aber es ist wichtig, für seine zentrale Rolle bei vielfältigen Prozessen wie neuronale Differenzierung und das überleben, Dendritische Wachstum, die synaptische Entwicklung, long-term-potentiation, Gedächtnisbildung und Erinnerung. Bdnf hat neun verschiedene Projektträger, Standorte, und jeder führt zu einer Variante mRNA-Transkript.
„Aufgrund dieser Komplexität versucht zu charakterisieren, unterschiedliche funktionelle Rollen der einzelnen Bdnf-mRNA in Neuronen produziert haben widersprüchliche Ergebnisse, und die derzeit verfügbaren Werkzeuge entweder fehlt die Fähigkeit, selektiv zu upregulate single Bdnf-Transkript-Varianten oder erfordern umständliche molecular cloning Protokolle zum generieren von gene-targeting-Konstrukte,“ der Tag, sagte.
Tag und Kollegen waren in der Lage, Ihre CRISPR-dCas9 system gezielt an einzelne Projektträger an zwei verschiedenen Standorten auf Bndf. Jeder induzierte nur das Transkript für die site, ohne Veränderung der expression in einem der anderen Projektträger. Dann zeichnet sich differentiell exprimierten Genen, die stromabwärts von jeder eindeutigen Transkript gemessen und die begleitenden Veränderungen in der neuronalen Physiologie.
Endlich, die Forscher überprüft die regulation Ihrer gene system in Erwachsenen Ratten, die mit stereotaktischer Operation zu infundieren CRISPRa-tragen lentiviren in den präfrontalen cortex, hippocampus und nucleus accumbens des Gehirns.