Neue next-generation-sequencing-Technik drastisch verkürzt sepsis-Diagnose
Ein Bericht im Journal of Molecular Diagnostics, veröffentlicht von Elsevier, beschreibt eine neue Technik, die mithilfe von real-time next-generation-sequencing (NGS) zur Analyse von winzigen Mengen der mikrobiellen Zell-freie DNA im plasma von Patienten mit sepsis, bietet die Möglichkeit, eine genaue Diagnose der sepsis-Erreger innerhalb weniger Stunden nach der Blutentnahme. Aktuelle diagnostische tests sind weder schnell noch spezifisch genug, um eine zeitnahe, kritisch wichtige Informationen.
„Mit bis zu 50 Millionen Vorfall sepsis-Fällen und 11 Millionen sepsis-Todesfälle pro Jahr, die sepsis stellt eine wesentliche Ursache für den Verlust der Gesundheit“, erklärte co-lead-Ermittler Thorsten Brenner, MD, stellvertretender Leiter der Abteilung für Anästhesiologie, Universitätsklinikum Heidelberg, Heidelberg, Deutschland. „Die zuverlässige und frühzeitige Identifizierung des Erregers ermöglicht eine schnelle und die am besten geeigneten Antibiotika-intervention, wodurch die chance auf bessere Ergebnisse und die überlebensrate der Patienten. Derzeit sind standard-of-care-Diagnostik verlassen sich immer noch auf die mikrobiologische Kultivierung der jeweiligen Krankheitserreger, die in den meisten Fällen (70 bis 90 Prozent) nicht rechtzeitige positive Ergebnisse.“
NGS umfasst mehrere erweiterte Verfahren verwendet, um die Sequenz der Nukleotide in der DNA. In früheren arbeiten, die Ermittler beschrieben, ein system, das genutzt NGS für mikrobielle Zell-freie DNA zu erkennen, Blut Krankheitserreger, die war sehr empfindlich und schneller als standard-blutkultur (innerhalb von 28 Stunden). Jedoch, Ihre ultimative Ziel war die Entwicklung einer noch schnelleren test zu beschleunigen, Behandlung.
Um diese Einschränkung zu überwinden, die die Ermittler etablierten diagnostischen workflow auf Basis der 3. generation mit hohem Durchsatz (nanopore), die Sequenzierung von mikrobiellen DNA. Normalerweise, nanopore-Sequenzierung wird verwendet, um zu analysieren, lange Fragmente in ausreichenden Mengen. Jedoch, microbial cell-free DNA tritt in kleinen Fragmenten und niedrigen Mengen im plasma. Nanopore-Sequenzierung bietet die Möglichkeit, Analysen in Echtzeit während der Sequenzierung, die drastisch reduziert die Zeit benötigt, um optimale Ergebnisse zu erhalten. „Wir hatten auch zu schaffen validiert, speziell bioinformatischen Verfahren, um zuverlässig Krankheitserreger identifizieren“, sagte principal investigator Kai Sohn, Ph. D., Fraunhofer-Institut für Grenzflächen-und Bioverfahrenstechnik, Stuttgart, Deutschland.
Diese neue Technik beruht auf der Verwendung eines handheld-nanopore sequencer bekannt als der MinION. Dieses Gerät ist tragbar, kann ausgelesen ultra-long-gelesen und sofort verarbeitet liest in Echtzeit.
In dieser proof-of-concept-Studie, die Ermittler analysiert plasma von vier septischen Patienten und drei gesunden Kontrollen, die wurden ins Krankenhaus eingeliefert in der Intensivstation. Jede Probe unterzog sich DNA-Sequenzierung unter Verwendung beider Technologien: die standard-NGS (Illumina) und die neue nanopore NGS-Technologie. Mit nanopore-Sequenzierung, alle septischen Patienten Proben waren positiv für relevante Krankheitserreger, egal ob Bakterien, Viren oder Pilz.
Nach weiteren Verfeinerungen, die neue Technik war in der Lage zu erreichen, einen 3,5-fachen Anstieg der Durchsatz-Sequenzierung, so dass Erreger-Identifizierung innerhalb von Minuten nach der Sequenzierung begonnen. In der Tat, die höchste Qualität der Ergebnisse generiert wurden, innerhalb von 2 oder 3 Stunden vor dem Beginn der Sequenzierung. Im Gegensatz dazu, mit Illumina die endgültigen Ergebnisse sind erst verfügbar, nachdem die Sequenzierung abgeschlossen ist. „Dieses neue system erleichtern könnten gleiche-shift-adaption von Antibiotika-intervention auf der ICU, die möglicherweise wiederum verbessern das Ergebnis für den Patienten deutlich“, kommentierte Dr. Sohn.
Die Forscher verglichen auch die Wahrscheinlichkeit der Erregernachweis mit der MinION system, die sehr genaue und klinisch validiert Illumina NGS-Technik in eine Retrospektive Analyse von 239 Proben von sepsis-Patienten. Obwohl die Genauigkeit der nanopore-Sequenzierung war geringer als bei Illumina (rund 85 Prozent gegen 99 Prozent), Sie fanden eine starke Korrelation zwischen den Ergebnissen erzeugt durch MinION vs. Illumina.