Medikamente blockieren CRISPR-Cas9-Genom identifiziert, Bearbeiten
Die Entdeckung des ersten klein-Molekül-Inhibitoren von Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) protein könnte damit genauere Kontrolle über die CRISPR-Cas9-basierten Genom-Bearbeitung, berichten Forscher vom 2. Mai in der Fachzeitschrift Cell.
Durch die Entwicklung einer Reihe von high-throughput-biochemische und Zellbasierte assays, die die Forscher geschirmt eine vielfältige Sammlung von kleinen Molekülen zu identifizieren verbindungen, die stören die Bindung von SpCas9 an die DNA und dadurch zu stören mit Ihrer Fähigkeit, DNA. Diese erste kleine Molekül CRISPR-Cas9-Hemmer leicht in die Zellen eindringen und sind viel kleiner als die zuvor entdeckten anti-CRISPR-Proteine. Die neuen compounds ermöglichen, umkehrbar und Dosis-abhängigen Kontrolle von SpCas9-basierten Technologien, einschließlich Ihrer Anwendungen für die gen-editing, base Bearbeiten und epigenetische Bearbeitung in säugerzellen.
„Diese Untersuchungen legen die Grundlage für die schnelle Identifikation und Einsatz von niedermolekularen Inhibitoren gegen beide SpCas9 und next-generation-CRISPR-nukleasen verbunden“, sagt senior-Autor Amit Choudhary von der Broad Institute, Harvard Medical School und Brigham and Women ‚ s Hospital. „Small-molecule Inhibitoren Ausrichtung CRISPR-associated-nukleasen haben das Potenzial für eine Breite Anwendung in der Grundlagenforschung, Biomedizin, Verteidigung und Forschung sowie in biotechnologischen Anwendungen.“
Derzeit SpCas9 entwickelt wird als Gentherapie-agent für mehrere Bedingungen, einschließlich HIV, vision-Erkrankungen, Muskeldystrophie, und anderen erblich bedingten Erkrankungen. Aber diese therapeutischen Anwendungen würden enorm profitieren von der präzisen Kontrolle über die Dosis und den Zeitpunkt der SpCas9 Aktivität zu verringern, die off-target-Effekte. Die Steuerung dieser Aspekte der SpCas9 Aktivität könnte profitieren auch andere Anwendungen, wie effizient der Bearbeitung des DNA-Modell-Organismen zu modellieren und zu studieren-Krankheit, und die Verwendung von gen-Laufwerke in gentechnisch veränderten Mücken engineering Mücken zur Eindämmung der Ausbreitung von malaria und andere Moskito-getragene Krankheiten.
Die Notwendigkeit der Dosis und der zeitlichen Kontrolle von SpCas9 hat eine Nachfrage für anti-CRISPR-Moleküle. Obwohl anti-CRISPR Proteine, die das Ziel SpCas9 existieren, Sie sind groß und undurchlässig für Zellen, irreversibel in Aktion, können gekaut werden, bis durch Proteasen, und kann das Risiko von unerwünschten Immunreaktionen im Körper. Durch Kontrast, klein-Molekül-Inhibitoren sind proteolytically stabil, reversibel und in der Regel nicht immunogen und können leicht geliefert werden, um Zellen durch passive diffusion. Darüber hinaus können Sie synthetisiert werden, die auf einem großen Maßstab bei geringen Kosten mit kleinen batch-zu-batch-Variabilität.
In der neuen Studie, Choudhary und sein team führte eine robuste, sensitive und skalierbare Plattform für die schnelle und Kosten-effiziente Identifizierung und Validierung von klein-Molekül-Inhibitoren SpCas9. Mess-CRISPR-Cas9-Aktivität in einem high-throughput-Weg würde es ermöglichen, dass für das Arzneimittel-screening wurde eine Herausforderung dar, da die Eigenschaften der SpCas9 Enzym. In dem neuen Papier, Choudhary und Kollegen entwickelten high-throughput-primäre und sekundäre assays für SpCas9-DNA-Bindung und SpCas9 DNA-schneidende Aktivität, beziehungsweise. Für den primären assay verwendeten Sie eine biochemische Technik, die sogenannte Fluoreszenz-Polarisations-überwachung der Interaktion zwischen SpCas9 und verknüpft-markierten DNA-segment mit PAM-Sequenzen. In der sekundären assay, die Sie verwendet, automatisierte Mikroskopie, Fluoreszenz Messen von Veränderungen, die durch SpCas9-vermittelte DNA-Spaltung eines reporter-Gens in Zellen.
Mit Hilfe dieser Tests, die Forscher zunächst gesiebt Vertreter der Mitglieder in verschiedenen Klassen von kleinen Molekülen zu identifizieren, die Klasse, deren Mitglieder Häufig gehemmt SpCas9. Das team identifiziert zwei Blei-verbindungen, die stören die Fähigkeit der SpCas9 binden die DNA und hemmen SpCas9-vermittelte DNA-Spaltung in einer Dosis-abhängigen Art und Weise in säugerzellen. Da blockieren Sie die DNA-Bindung durch das Enzym diese Moleküle hemmen auch katalytisch-beeinträchtigt Technologien SpCas9, einschließlich derjenigen, die für die transkriptionelle Aktivierung, und sind stabil im menschlichen plasma.
„Diese Ergebnisse legen den Grundstein für präzise Chemische Kontrolle über die CRISPR-Cas9-Aktivitäten, ermöglicht den sicheren Einsatz solcher Technologien“, sagt Choudhary. „Jedoch, diese Moleküle, die nicht bereit sind, für Anwendungen bei Menschen und nicht getestet Wirksamkeit in Organismen.“
In zukünftigen Studien wollen die Forscher planen, identifizieren Sie die Inhibitoren Bindungsstellen auf der SpCas9:gRNA-Komplex, untersuchen Ihre Wirkungsweise und Optimierung Ihrer Wirksamkeit. Sie wird auch bestimmen, ob die Moleküle interagieren mit anderen Zielen in säugetier-Zellen, und zu beurteilen, Ihre Besonderheit gegenüber anderen CRISPR-nukleasen verbunden. Frühe Ergebnisse in der Zelle Papier zeigen, dass die Moleküle ganz spezifisch für Ihr Ziel, denn Sie haben keinen Effekt auf ein entfernt-Verwandte CRISPR Enzym, Cas12a.